2026.07.08

1. 基于 CELLCYTE X 活细胞成像系统的细胞毒性检测

将 5000 个经 mCherry 荧光标记的靶细胞（CaSki 细胞、原代宫颈癌细胞）接种于 96 孔培养板；CAFs 采用红色荧光示踪剂标记。次日按照不同效应细胞 / 靶细胞（E:T）比例加入 NK 细胞，其中 CAFs 与 NK 细胞固定效靶比 1:1 共培养。 NK-92 细胞使用添加 400 IU/mL 白细胞介素 - 2（IL-2）的 RPMI-1640 完全培养基培养；原代脐带血 NK 细胞（pNK）使用含 400 IU/mL IL-2、35 ng/mL 白细胞介素 - 15（IL-15）的 NK MACS 专用培养基培养。将培养板置于 CELLCYTE X 活细胞成像系统中，每 2 h 自动成像 1 次，连续监测 72 h，动态分析靶细胞存活与增殖状态。

单一肿瘤球体模型：将 1000 个 mCherry 标记的靶细胞接种于超低吸附 96 孔板，常规培养 3 天形成稳定 3D 肿瘤球体。按不同 E:T 比例加入含 400 IU/mL IL-2 的 NK-92 细胞，置于 CELLCYTE X 活细胞成像系统中，每 4 h 成像 1 次，持续监测 72 h。

混合肿瘤球体模型：将 500 个 mCherry 标记 CAFs 与 500 个 eGFP 标记宫颈癌细胞（SiHa/HeLa）混合接种，培养 3 天构建模拟原生肿瘤微环境的混合球体。后续加样、成像参数与单一球体模型一致。

2. 其他辅助实验

本研究联合多种分子生物学与细胞生物学技术开展机制验证：采用免疫组织化学、流式细胞术定量检测宫颈癌组织、细胞系及原代细胞中 FAP 的表达水平；利用 α 逆转录病毒自失活（SIN）载体构建第三代抗 FAP CAR 载体并制备病毒上清；使用重组纤连蛋白片段、Synperonic F-108 试剂分别辅助 NK-92 细胞与原代脐带血 NK 细胞完成病毒转导；通过实时荧光定量 PCR（qPCR）检测载体拷贝数、蛋白质免疫印迹（Western blot）验证 CAR 蛋白表达；利用流式细胞术定量检测共培养体系中残留靶细胞、检测 CD107a 表达水平，评价 NK 细胞脱颗粒与活化能力；采用 LEGENDplex 多重流式试剂盒检测细胞上清中细胞因子、细胞毒性相关蛋白的分泌量。所有实验数据均使用 GraphPad Prism 软件进行双因素方差分析等统计学检验。

2. 抗 FAP CAR-NK-92 细胞的靶向特异性验证

来自 5 例患者的原代 CAFs 单独培养 24~48 h 后，荧光面积扩增 2 倍，增殖活性显著。共培养体系中，未修饰 NK-92 细胞对 CAFs 杀伤能力有限，而抗 FAP CAR-NK-92 细胞可有效清除 CAFs（图 4B）；共培养 48 h 后，原本呈梭形的 CAFs 形态转变为圆形（补充图 S8），该形态变化在两个对照组中均未出现。实验选取 FAP 阴性的原代宫颈癌细胞 CP5、CP17 开展特异性验证：两类细胞增殖能力很强，48 h 内荧光面积分别扩增 6.9 倍、3.5 倍。各实验组 NK 细胞仅能轻微抑制其增殖，且抗 FAP CAR-NK-92 细胞与未修饰 NK-92、ΔCAR-NK-92 细胞的杀伤效果无统计学差异（图 4C，补充图 S10）。上述结果明确：抗 FAP CAR-NK-92 细胞仅靶向杀伤 FAP 阳性细胞，具备优异的抗原特异性。

图 4. 抗 FAP CAR-NK-92 细胞清除原代宫颈癌来源的细胞

S8.原代宫颈癌症相关成纤维细胞的细胞毒性实验结果

S10.原代宫颈癌细胞毒性实验成像图

3. 3D 单一肿瘤球体模型中的杀伤效果

构建 CaSki 细胞及多例原代 CAFs（CP2、CP3、CP4、CP6）3D 肿瘤球体，单独培养 72 h 内球体总荧光强度保持稳定。

共培养结果表明：不同 E:T 比例下，抗 FAP CAR-NK-92 细胞均可显著降低 CaSki 球体荧光强度；ΔCAR-NK-92 细胞虽有微弱杀伤作用，但无统计学差异（图 5A）。相较于单一癌细胞球体，抗 FAP CAR-NK-92 细胞对 CAFs 球体的杀伤效果更强：E:T=1:1 时，CP2 球体培养 34 h 荧光强度下降 50%，72 h 降幅达 83%；CP3 球体可被完全清除，提升 E:T 比例还能进一步缩短起效时间。CP4 球体在实验早期可被 CAR 细胞有效杀伤，后期与对照组效果趋于一致；培养 72 h 后，抗 FAP CAR-NK-92 细胞几乎完全清除 CP6 球体，杀伤效果显著优于对照组（图 5A）。

图 5.抗 FAP CAR-NK-92 细胞对 3D 肿瘤球体的清除效果

4. 3D 混合肿瘤球体模型中的杀伤效果

利用 eGFP 标记宫颈癌细胞（SiHa、HeLa）与 mCherry 标记原代 CAFs（CP2、CP3、CP6）构建混合 3D 球体，模拟真实肿瘤微环境。

形态观测发现：CAFs 集中于球体核心，宫颈癌细胞环绕其外周（图 6A），该空间分布规律不受细胞接种顺序影响；单独培养的 CAFs 荧光强度 72 h 内基本稳定，与癌细胞共培养后荧光出现自然衰减（图 6A）。在 E:T=1:1 条件下，未修饰 NK-92 细胞、ΔCAR-NK-92 细胞仅能造成球体核心松散，对 CAFs 杀伤作用极弱；而抗 FAP CAR-NK-92 细胞可使 CAFs 荧光强度下降 90%，杀伤效果突出。针对 CP3、CP6 来源 CAFs，抗 FAP CAR-NK-92 细胞同样展现出高效杀伤能力（图 6B），进一步证明其在复杂三维肿瘤微环境中，仍可稳定穿透并靶向清除免疫抑制性CAFs。

图 6. 混合 3D 球体模型中抗 FAP CAR-NK 细胞清除宫颈癌症相关成纤维细胞

5. 原代脐带血 CAR-NK 细胞的抗肿瘤活性评价

单独培养的 CaSki 细胞 72 h 内荧光面积扩增 9.6 倍。1:1 E:T 比例下，pNK 可明显抑制靶细胞增殖，整体活性优于 NK-92 细胞，但不同供体来源 pNK 细胞存在活性差异，部分供体细胞可使靶细胞荧光面积下降 15%~25%（图 7C）。 经抗 FAP CAR 修饰后，pNK 细胞的杀伤能力大幅提升：培养 72 h 后，3 名供体来源的 CAR-pNK 细胞分别使靶细胞荧光面积下降 51%、63%、67%。细胞因子检测结果显示：pNK 细胞与 CaSki 细胞共培养后，sFasL、IFNγ、TNFα、颗粒酶 B 等活化及细胞毒性相关因子分泌量显著上调。其中，2 号供体 CAR-pNK 细胞杀伤能力提升，与 IFNγ、颗粒酶 B 分泌增加直接相关；其余细胞因子表达水平在各组间无明显差异（图 7C）。

图 7. 脐带血来源原代抗 FAP CAR-pNK 细胞清除宫颈癌细胞

本研究成功构建了第三代抗 FAP CAR-NK 细胞，可在 2D 共培养体系、3D 肿瘤球体（单一 / 混合）模型中，高效、特异性地杀伤 FAP 阳性宫颈癌细胞与癌症相关成纤维细胞，对 FAP 阴性细胞无明显作用，靶向安全性良好。

在整个研究体系中，CELLCYTE X 活细胞成像系统发挥了核心作用：依托定时连续成像功能，每 2 h 或 4 h 实时追踪荧光标记靶细胞的形态、数量及荧光强度变化，直观量化 CAR-NK 细胞的杀伤动力学；精准捕捉到 CAR-NK 细胞数小时内快速起效并破坏 3D 混合球体结构的动态过程，为体外药效评价提供了可视化、可量化的核心数据。

综上，抗 FAP CAR-NK 细胞可同时靶向宫颈癌细胞与肿瘤微环境中的 CAFs，有效突破免疫抑制屏障，是治疗宫颈癌的一种潜在有效疗法，同时该策略也可拓展应用于其他 FAP 高表达的肿瘤及纤维化相关疾病。

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